Rozbrajanie toksyn

Więc kimże w końcu jesteś?
– Jam częścią tej siły, która wiecznie zła pragnąc, wiecznie czyni dobro”

Czy powyższy cytat z powieści Bułhakowa „Mistrz i Małgorzata”, opisujący znaczenie diabła w świecie, można wykorzystać do scharakteryzowania roli toksyn, jaką odgrywają we współczesnej medycynie?

Zapewne każdemu z nas na słowo toksyna przychodzą same najgorsze skojarzenia. Nic dziwnego, bo to przecież bakteryjne toksyny i wywoływane przez nie choroby zakaźne w głównej mierze od wielu wieków są odpowiedzialne za dziesiątkowanie ludności na całym świecie. Weźmy jako przykład choćby „Czarną Śmierć” czyli dżumę, która w XIV wieku zabiła ok. 25 milionów Europejczyków, czy epidemię cholery, która w XIX w. zdziesiątkowała mieszkańców Indii i przyniosła śmierć wielu tysiącom mieszkańców Ameryki Północnej i Europy.

Negatywne skojarzenia z toksynami bakteryjnymi są związane przede wszystkim z zakażeniami oraz zatruciami pokarmowymi wywołanymi przez chorobotwórcze bakterie, takie jak te z rodzaju Salmonella, Listeria czy Escherichia. Strach przed toksynami jest także wywołany obecnością chorobotwórczych bakterii w rękach terrorystów, którzy w każdej chwili mogą wykorzystać produkowane przez te bakterie toksyny jako broń biologiczną. Nic dziwnego – wykorzystanie bakterii i ich toksyn jako broni biologicznej jest stosowane przez ludzkość od setek lat.

Za inicjatorów użycia broni biologicznej uznaje się Tatarów, którzy już w 1346 roku podczas wycofywania swoich wojsk nad Morzem Czarnym, przerzucali katapultami na teren ufortyfikowanej Kaffy ciała swoich zmarłych na dżumę żołnierzy. W efekcie, przerażeni mieszkańcy portu uciekali do innych europejskich miast zabierając ze sobą śmiercionośną bakterię, co przyczyniło się do rozprzestrzenienia epidemii dżumy w całej Europie.

Ogromny wzrost zainteresowania bronią biologiczną nastąpił w okresie międzywojennym i Zimnej wojny. Szczególne zainteresowanie badaniami w kierunku rozwoju broni biologicznej wykazywały Stany Zjednoczone, Związek Radziecki, Anglia, Irak oraz Chiny. Na nasze szczęście, w roku 1972 większość państw podpisała traktat zakazujący prowadzenia badań, produkcji czy gromadzenia środków mikrobiologicznych. Niestety, nie wyklucza to użycia broni biologicznej przez kraje, które tego traktatu nie podpisały oraz przez terrorystów. Dowodem na to może być choćby atak wąglikowy w USA z 2001 r. z użyciem listów zaadresowanych do biur agencji informacyjnych oraz senatorów, zawierających przetrwalniki wąglika (Bacillus anthracis), czy kilkukrotne próby rozpylenia w Tokio toksyny z bakterii jadu kiełbasianego (Clostridium botulinum) przez sektę terrorystyczną „Najwyższa Prawda”. Na szczęście przekształcenie toksyny jadu kiełbasianego w śmiercionośny aerozol okazało się niewykonalne (toksyna ulegała degradacji) i każda z prób ataku kończyła się niepowodzeniem. Mimo to warto sobie uświadomić jak ogromne ryzyko i skalę zniszczeń może nieść ze sobą udane wykorzystanie jadu kiełbasianego jako broni biologicznej. Toksyna wydzielana przez bakterię jadu kiełbasianego jest jedną z najbardziej niebezpiecznych dla człowieka substancji – jej dawka śmiertelna wynosi 0,0004 mg, a już nawet 1 gram tej toksyny po przedostaniu się drogą oddechową do krwioobiegu może doprowadzić do śmierci ok. 1,5 miliona ludzi. Mechanizm działania toksyny botulinowej polega na blokowaniu przekazywania impulsów nerwowych pomiędzy komórką nerwowa a komórką mięśniową, prowadząc do paraliżu mięśni, a tym samym do ich rozluźnienia i zwiotczenia. Dlatego już po kilku minutach od wniknięcia toksyny jadu kiełbasianego drogą wziewną dochodzi do porażenia układu oddechowego zaatakowanego organizmu, a w konsekwencji do śmierci przez uduszenie.

Specyficzny mechanizm działania toksyny botulinowej sprawił, że świat nauki bardzo szybko postanowił uważniej się jej przyjrzeć, aby w przyszłości móc ją (a właściwie jej paraliżujące właściwości) wykorzystać w medycynie. W 1978 r. amerykański okulista dr Alan Scott po zakończonych sukcesem próbach wywołania za pomocą toksyny botulinowej rozluźnienia skurczu powiek u małp uzyskał zgodę Amerykańskiej Agendy ds. Żywności i Leków (FDA) na badania wykorzystujące tę toksynę w leczeniu zeza u ludzi. Aktualnie toksyna jadu kiełbasianego z powodzeniem jest wykorzystywana w medycynie w celach terapeutycznych: leczenie kurczu powiek, zeza, spastyczności mięśni, dystonii szyjnej oraz jako środek przeciwbólowy. Jednak największą sławę i popularność (szczególnie wśród celebrytów) toksyna botulinowa uzyskała w momencie wykupienia prawa do jej sprzedaży przez firmę Allergan. Ten koncern farmaceutyczny wprowadzając w roku 2002 na rynek toksynę botulinową pod nazwą handlową Botox całkowicie zrewolucjonizował świat medycyny estetycznej. Lawinowo wzrosła liczba zabiegów redukcji zmarszczek.

Dyfteryt – dusiciel

Ludzkość od wieków nawiedzały groźne choroby wywoływane przez bakterie, które za sprawą produkowanych przez siebie toksyn uśmiercały swoje ofiary, nie zważając na ich wiek, płeć czy status społeczny. Wiele z tych chorób nie oszczędzało również dzieci – szkarlatyna, krztusiec czy błonica to tylko kilka przykładów chorób, które okazały się tragiczne w skutkach dla najmłodszych.

Jedną z najczęstszych przyczyn wysokiej śmiertelności dzieci w Europie w XIX w była błonica (dyfteryt). Ta groźna choroba zakaźna w samej Europie wywołała śmierć blisko 80% dzieci w wieku poniżej 10 roku życia. Na szczęście obecnie, dzięki wprowadzeniu obowiązkowych szczepień, dyfteryt w Europie został prawie całkowicie wyeliminowany. Dyfteryt jest chorobą zakaźną wywoływaną przez bakterię maczugowca błonicy (Corynebacterium diphtheriae), która dostając się do organizmu drogą kropelkową lub przez bezpośredni kontakt z chorą osobą, zasiedla się błonach śluzowych górnych dróg oddechowych, prowadząc do powstania charakterystycznych, błonkowatych narośli w obrębie gardła. Często tym objawom towarzyszy mdły zapach wydobywający się z ust chorej osoby oraz powiększenie węzłów chłonnych. Postępująca infekcja, w wyniku rozrostu błon, powoduje zwężenie krtani, co utrudnia prawidłowe połykanie i oddychanie. W ostatnim stadium choroby, w wyniku porażenia układu nerwowego może dojść do uszkodzenia narządów wewnętrznych, śpiączki, a nawet do śmierci – ofiara po prostu się udusi. Czynnikiem decydującym o patogennych właściwościach maczugowca błonicy jest wytwarzana przez bakterię toksyna.

Toksyna błonicy (toksyna dyfterytu, DT) należy do grupy egzotoksyn, czyli białkowych toksyn, które są wydzielane przez komórki bakteryjne do środowiska zewnętrznego. Toksyna przenika przez uszkodzone błony śluzowe swojej ofiary do krwioobiegu, prowadząc do uszkodzenia wielu narządów. Jednak zanim do tego dokona, toksyna błonicza musi spotkać na swojej drodze bezpośredni cel działania – czynnik EF-2, uczestniczący w syntezie białka w komórce. Żeby zrozumieć w jaki sposób niewielka cząsteczka toksyny błoniczej potrafi uśmiercić człowieka, należy uważnie przyjrzeć się jej budowie i mechanizmowi działania.

Toksyna błonicza składa się z dwóch połączonych ze sobą podjednostek: A i B, ale tylko podjednostka A jest w stanie unieczynnić czynnik EF-2 i zahamować syntezę białek, a tym samym uśmiercić komórkę. Do czego jest zatem potrzebna podjednostka B? Uwolniona przez bakterię do środowiska zewnętrznego toksyna dyfterytu (DT) właśnie za pośrednictwem podjednostki B przyłącza się do powierzchni komórek, czyniąc z nich swoją ofiarę. Przyłączona do powierzchni komórki toksyna jest następnie wciągana wraz z fragmentem błony komórkowej do jej wnętrza. W otaczającym ją błoniastym pęcherzyku toksyna, za sprawą panujących wewnątrz kwaśnych warunków (niskiego pH), ulega rozpadowi na dwie oddzielne podjednostki A i B. Od tego momentu pierwsze skrzypce w rozwoju infekcji zaczyna odgrywać podjednostka A, która wydostając się na zewnątrz pęcherzyka do cytoplazmy wypełniającej wnętrze komórki, wiąże się z czynnikiem EF-2 i go unieczynnia. Proces ten powoduje całkowite zahamowanie syntezy białek, co w efekcie prowadzi do poważnych powikłań na poziomie funkcjonowania poszczególnych narządów: wątroby, nerek, nadnerczy, powoduje też neuropatie, zapalenie i niewydolność mięśnia sercowego, a także wywołuje porażenie i utratę motoryki mięśni. W wyniku porażenia ośrodkowego układu nerwowego, a w konsekwencji mechanicznego zablokowania pracy dróg oddechowych oraz martwicy narządów wewnętrznych, nieuchronnie prowadzi do śmierci.

Magiczne pociski

Mechanizm działania i zabójcze właściwości toksyny dyfterytu znalazły się w centrum zainteresowań niemieckiego chemika i bakteriologa – Paula Ehrlicha. Zainteresowania naukowe tego urodzonego w Strzelinie pod Wrocławiem naukowca, noblisty w dziedzinie immunologii, koncentrowały się na tematyce układu odpornościowego, ale przez wiele lat prowadził on także badania w kierunku stworzenia cudownego leku – „magicznego pocisku”, który byłby w stanie zniszczyć ognisko choroby nowotworowej, a jednocześnie byłby bezpieczny dla zdrowych komórek organizmu. Według Ehrlicha, stworzenie takiego leku byłoby możliwe poprzez połączenie toksycznego dla komórki białka z cząsteczką, która z dużą dokładnością rozpoznawałaby komórki nowotworowe. W ten sposób toksyna zamiast krążyć we krwi i siać spustoszenie w organizmie byłaby precyzyjnie dostarczona do określonego typu komórek. Niestety, nie udało się Ehrlichowi zrealizować swoich marzeń o cudownym leku, ale i tak dzięki swoim odkryciom, m.in. wynalezieniu leku przeciw kile, został okrzyknięty ojcem chemioterapii.

Musiało minąć blisko 60 lat od śmierci Ehrlicha, aby świat się dowiedział, że wizja tego niemieckiego badacza o cudownym „pocisku”, nie była jedynie mrzonką, ale była pierwszym krokiem w kierunku nowoczesnej chemioterapii.

W 1978 r. na łamach czasopisma „Nature” angielscy naukowcy pod kierunkiem profesora Anthony’ego Daviesa jako pierwsi opisali stworzoną przez nich „cudowną cząsteczkę”. Tym samym pokazali światu, że to co jeszcze w XIX wieku było śmiertelnym niebezpieczeństwem, od tej chwili może ratować ludzkie życie. W ten sposób narodziły się leki przyszłości – immunotoksyny.

Davies i jego współpracownicy opracowali model immunotoksyn, które miały unicestwiać tylko jeden rodzaj komórek – komórki nowotworowe chłoniaka limfoblastycznego. Stworzyli cząsteczkę składającą się z dwóch elementów, w której jeden z nich miał za zadanie specyficznie rozpoznawać określony typ komórek i się do nich przyłączać, a drugi posiadał właściwości toksyczne i powodował śmierć komórki nowotworowej. Do rozpoznania komórki docelowej i dostarczenia do niej toksycznego fragmentu wykorzystano przeciwciało – białkową cząsteczkę, która specyficznie wiąże się do określonych struktur na powierzchni komórek. Natomiast rolę toksycznego elementu składowego immunotoksyny odegrała toksyna dyfterytu. Taka budowa pozwoliła immunotoksynie dotrzeć do określonego typu komórek, a po wniknięciu do ich wnętrza zahamować produkcję niezbędnych do życia białek prowadząc do śmierci komórek nowotworowych. Bardzo szybko okazało się, że do stworzenia skutecznej immunotoksyny nie jest potrzebna cała cząsteczka toksyny dyfterytu, a jedynie jej podjednostka B.

Kolejne lata przyniosły niezwykle szybki rozwój technik tworzenia immunotoksyn, co pozwoliło zmniejszyć ich immunogenność, czyli zdolność do wywołania przeciwko sobie swoistej odpowiedzi odpornościowej, jak również obniżyć niepożądaną cytotoksyczność w stosunku do zdrowych komórek. W związku z tym podjęto próby wykorzystywania nowych cząsteczek o wysokim powinowactwie do struktur powierzchniowych znajdujących się na komórkach nowotworowych. Tę rolę, poza przeciwciałami lub ich fragmentami, zaczęły pełnić m.in. hormony, czynniki wzrostu czy cytokiny. Postępy w badaniach nad immunotoksynami dotyczyły również elementu cytotoksycznego, w wyniku czego zaczęto stosować jeszcze bardziej niebezpieczne, a tym samym skuteczniejsze toksyny pochodzące z różnych organizmów, np. rycynę z  rącznika pospolitego, toksynę  z jadu kobry indochińskiej Naja siamensis czy stychiolizynę z morskiego ukwiału Stichodactyla helianthus. Jednak wciąż największym powodzeniem cieszyły się (i cieszą do tej pory) toksyny pochodzenia bakteryjnego: toksyna błonicza oraz egzotoksyna A z pałeczki ropy błękitnej Pseudomonas aeruginosa.

Wreszcie, w 1999 roku marzenie Erlicha o „magicznym cząsteczce” zaczęło się urzeczywistniać – FDA zatwierdziła do użytku klinicznego pierwszą immunotoksynę-  denileukin diftitox (DAB389IL2). DAB389IL2, który zostały stworzony w celu leczenia białaczki (skórnej postaci chłoniaka T-komórkowego) jest połączeniem podjednostki B toksyny dyfterytu z cytokiną- interleukiną 2 (IL-2) o wysokim powinowactwie do receptora IL-2, którego duże ilości występują na powierzchni wielu komórek nowotworowych.

W krótkim czasie okazało się, że terapie z zastosowaniem immunotoksyn nie muszą ograniczać się jedynie do leczenia chorób nowotworowych. Ukierunkowany transport toksycznych białek do komórek charakteryzujących się wzmożoną syntezą określonych cząsteczek na swojej powierzchni wykorzystano także w leczeniu chorób autoimmunologicznych. Dotychczasowe badania przedkliniczne z udziałem immunotoksyny zawierającej rycynę dały obiecujące wyniki dotyczące jej właściwości terapeutycznych w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów. Także wspomniany wcześniej denileukin diftitox znalazł swoje zastosowanie w leczeniu m.in. reumatoidalnego zapalenia stawów oraz łuszczycy.

Poznawanie mechanizmów działania toksyn, poszukiwanie cząsteczek specyficznie rozpoznających różnorodne elementy na powierzchni komórek nowotworowych oraz postęp w pracach nad zrozumieniem procesu powstawania nowotworów czy chorób autoimmunologicznych, to główne wyzwania jakie stawia się dzisiejszej nauce. Pozostaje mieć nadzieję, że dalsze badania nad immunotoksynami zaprocentują stworzeniem w pełni skutecznej i bezpiecznej celowanej terapii antynowotworowej. Bo bez względu na to, w jaki sposób obecnie jesteśmy w stanie walczyć z nowotworami, to wciąż będziemy oczekiwać kolejnych, idealnych „magicznych pocisków” Ehrlicha.

Magdalena Kulma jest doktorem nauk biologicznych. Pracuje w Instytucie Biochemii i Biofizyki PAN. Należy do Stowarzyszenia Rzecznicy Nauki.